药物简介

　 概述

　 1906年，Carnot等人将贫血动物的血清注射给兔子，2天后发现兔子血液中红细胞数量增加了20～40%，根据这一现象，Carnot等人提出存在一种体液因子，它可以调节红细胞的生成。1953年Etslev等人的工作为这种因子的存在提供了直接的证据。在实验中，发现给予贫血动物的血清后，动物体内有网织细胞生成现象，同时造血机能增强。根据前人研究的结果，Bonsdorff与Jalavisto于1948年提出了"红细胞生成素"（erythropoietin EPO）的概念，以表明该因子对红细胞生成的特异性刺激作用。
　 现在研究表明，红细胞生成素是一种糖蛋白，在胎儿体内由肾脏及肝脏产生，而在成人体内主要由肾脏产生。肾功能受到损害，如在慢性肾衰竭的病人中，红细胞生成素的产生受到妨碍，可导致贫血的产生。正常人体内血液中红细胞生成素的含量为10～18毫单位/毫升。当体内缺氧时，红细胞生成素的含量可提高到1000倍以上。红细胞生成素与靶细胞如骨髓细胞、脾细胞、胎儿肝细胞上特定位点结合，从而促进红细胞前体细胞的增殖、分化并成熟为红细胞，增加骨髓向循环血中红细胞的释放量。由此可见，红细胞生成素是一种重要的造血生长因子，对体内红细胞的生成起着不可缺少的调控作用。由于该体液因子能刺激红细胞的生成，同时其作用限于红细胞系，故将其命名为“红细胞生成素”是很恰当的。

　红细胞生成素的分类

　　1．天然红细胞生成素
　　天然红细胞生成素是以人或动物的尿、血等为原料，经生物化学方法纯化得到的红细胞生成素。接种属不同可分为人红细胞生成素、小鼠红细胞生成素、猴红细胞生成素等。目前已知人红细胞生成素以两种形式存在，即人红细胞生成素-α(EPO-α)及人红细胞生成素子-β(EPO-β)，二者氨基酸组成及顺序相同，都含有166个氨基酸残基。分子量、等电点及生物活性也都类似，差别在于二者的糖型组成不同，EPO-α含有较多的N-乙酰葡糖胺，总的含糖量也较EPO-β高。
　　2．非天然红细胞生成素
　　非天然红细胞生成素主要是指重组人红细胞生成素，即以重组DNA技术生产的红细胞生成素，将红细胞生成素的基因连接到表达载体上，用以转化CHO细胞，从细胞的培养上清中纯化得到EPO。重组人红细胞生成素与天然人红细胞生成素具有相同的体内、体外活性，比活则更高些。同天然人红细胞生成素一样，基因工程人红细胞生成素依据糖基结构的差异也可分为α、β两种，即rHEPO-α和 rHEPO-β。

　 红细胞生成素的特性

　　1．EPO的化学特征

　　EPO是一种精蛋白，分子量约为30～39KD。天然和重组EPO脱糖基后在体外仍有很强的生物活性，但在体内却没有活性。
　　纯化的人尿EPO有两个链内二硫键，这两个键在变性EPO复性时折叠成有生物活性构型的过程中是必不可少
的，直接测定的人尿EPO的氨基酸顺序与从编码EPO的基因推测的氨基酸顺序相同。重组人EPO有3个N糖基化位点
（24，38，83位的天冬酰胺残基），126位的丝氨酸残基为O糖基化位点。
　　天然和重组的人EPO分子结构并无差别，用沉淀平衡法测定EPO分子量为30400D，其中肽键部分从其氨基酸组成序列推算为18398D，则糖链占分子量的39%。圆二色谱表明人EPO肽链骨架50％为α-螺旋，其余的为无规线团结构，两个反平行的α一螺旋组成类似于生长激素的结构。EPO分子中的糖键结构也已明确。126位O糖链的主要组成为N－NeuNAC α-2→3Gal β1→3 (NeuNAC α-6) Gal NAcOH－丝氨酸。各种N连接寡糖链结构占总含糖量的百分率分别为：双末梢糖链1.4%，三末梢糖链10%，带有一个N-乙酰氨基半乳糖重复单位的三末梢糖链3．5%，四末梢糖链31.8%，带有一个、两个和三个N-乙酰氢基半乳糖重复单位的四末梢糖链分别为32.1%， 16.5%和4.7%。所有这些寡糖链都被以α2→3连接方式唾液酸化了。其中四末梢糖健被2个或3个唾液酸残基唾液酸化。另外还发现天然和重组人EPO只在唾液酸含量有微小差异，其它糖键结构并无不同。未经O糖基化的重组人EPO的体内外活性及体内清除速率与完全糖基化的EPO无差别，N糖基化不完全的重组人EPO体外活性正常，而体内活性则降低到体外活性的1/500，其体内被清除的速率也明显加快。糖基化EPO对热和PH变化稳定，等电点明为4.2～4.6，未经根基化肽链等电点PH为9.2。

　2. EPO的分子生物学

（1）EPO基因的结构与染色体定位

　　1985年Jacobs等先后克隆了人、猴和小鼠EPO基因。人和小鼠EPO基因从整体上说是保守的。人和小鼠EPO基团均有5个外显子，外星子的长度和序列是高度保守的。各内含于除第一个有中等程度的保守性外，其余内含子均无保守性。5'端和3'端的非编码区也有一定程度的保守性。人EPO基因中转译起始密码上游600个碱基的区域内没有TATA盒和CCAAT盒一样的启动子结构，基因中也不存在多腺苷序列AAUAAA，在人EPO基因中，5'侧可转录的非编码区比其它基因长，而且转译是从mRNA的第二个AUG密码子开始的。人EPO基因位于第7号染色体的q11-12区，含有两个等位基因。

（2）EPO基因的表达

　　现在已经证实肾脏是成年动物EPO的主要来源。原位杂交表明肾脏皮质肾小管周围的细胞及髓质外层细胞是产生EPO的部位。小鼠细胞系IW32可持续地分泌EPO，其中有正常的和重排放大的EPO基因。重排的基因位点含有正常的EPO基因及下游序列，但上游却增加了正常基因所没有的酶切位点。重排EPO基因上游4.5kb和下游9.5kb区域内没有原病毒整合，也没有发现EPO基因插入到逆转录病毒基因组中，重排后的基因转录可能是由于重排使一个处于转录状态的基因与EPO基因非常接近，但其转录方向与EPO基因转录方向相反，从而通过双向转录引起EPO基因的转录。

（3）EPO的生物效应及作用机理

　　靶细胞受EPO刺激后先是细胞质内Ca2+的聚集。FVA细胞在4℃受高浓度EPO刺激1分钟后其细胞质内即有Ca2+聚集。单个红系前体细胞受EPO刺激后细胞质中Ca2+浓度升高，这是由于细胞内Ca2+的重新分布，而不是因为细胞外Ca2+进入了细胞。EPO作用于靶细胞后的另一效应是使细胞内DNA合成增加。如无EPO存在，即使增加细胞质内Ca2+浓度，也不能使红系前体细胞向红系细胞分化，说明Ca2+很可能在红系细胞的增殖和分化中起辅助作用。
　　 此外，缺氧小鼠注射EPO后0.5－2.0小时，其脾脏中红系造血前体细胞RNA聚合酶II活性增强，3一12小时后RNA聚合酶I活性增强，非组蛋白合成增强。12－14小时后RNA酶II活性再次增强，同时DNA聚合酶一α活性增强，组蛋白合成增加。48小时后，DNA合成量达最大值。
　　血红蛋白的合成也受EPO的影响，骨髓被抑制和刺激的大鼠骨髓细胞在体外培养中加入EPO后2小时其球蛋白mRNA水平即出现差别。FAV细胞在体外经EPO刺激后6小时有β一球蛋白mRNA生成。纯化的CFU－E经EPO作用后不到1小时有球蛋白mRNA转录。以上结果表明球蛋白基因的转录可能是EPO对造血细胞的的最早的效应。
　　红细胞过多的大鼠，骨髓红细胞生成受到严重抑制。这种细胞有足量的合成血红蛋白的酶，但不能合成血红蛋白。经EPO刺激后有胆色素原脱氨酶出现，用于血红素合成的酶没有变化。这一限速酶的合成在EPO刺激后20～24小时出现。
　　此外，FAV细胞经EPO刺激后6小时，转铁蛋白结合位点开始增加，到24小时后增加1倍。骨髓抑制的大鼠骨髓细胞体外培养表明，EPO可促进骨髓细胞表达一些红细胞膜成分及一些在红系细胞分化过程中只一过性地表达的成分，说明EPO对造血细胞有多方面的作用。

　 重组人红细胞生成素的肽链结构

ALA PRO PRO ARG LEU ILE CYS ASP SER ARG VAL LEU GLU ARG TYR LEU LEU GLU ALA LYS GLU ALA OLU ASN* ILE THR THR GLY CYS ALA GLU HIS CYS SER LEU ASN GLU ASN* ILE THR VAL PRO ASP THR LYS VAL ASN PHE TYR ALA TRP LYS ARG MET GLU VAL GLY GLN GLN ALA VAL GLU VAL TRP GLN GLY LEU ALA LEU LEU SER GLU ALA VAL LEU ARG GLY GLN ALA LEU LEU VAL ASN* SER SER GLN PRO TRP GLU PRO LEU GLN LEU HIS VAL ASP LYS ALA YAL SER GLY LEU ARG SER LEU THR THR LEU LEU ARG ALA LEU GLY ALA GLN LYS GLU ALA ILE SER PRO PRO ASP ALA ALA SER** ALA ALA PRO LEU ARG THR ILE THR ALA ASP THR PHE ARG LYS LEU PHE ARG VAL TYR SER ASN PHE LEU ARG GLY LYS LEU LYS LEU TYR THR GLY GLU ALA CYS ARG THR GLY ASP ARG

　 益比奥简介

　　益比奥是应用基因工程技术，从含有人红细胞生成素基因的中国仓鼠卵巢细胞(CHO细胞)培养液中提取到的。它是含有165个氨基酸的糖蛋白，分子量为34KD左右，具有与正常人体存在的天然红细胞生成素相同的生理功能，可促进骨髓红系祖细胞的分化和增殖。
　　益比奥为无色透明液体。PH6.9±0.3，内含重组人红细胞生成素、蛋白质稳定剂和缓冲盐溶液等。

　益比奥临床前资料

　药效学

　　由中国药品生物制品检定所完成，采用SD清洁级雄性大鼠，口服0.75%腺嘌呤饲料致慢性肾衰性贫血后，每天分别给上述大鼠皮下注射沈阳三生制药股份有限公司益比奥500u/kg、250u/kg及50u/kg，连续注射14天，同时以美国Amgen公司 rhuEPO为阳性对照（注射剂量为25u/kg），对其药效进行了研究，结果如下：

　　1．一般状态
　　已造成慢性肾衰性贫血大鼠，出现多饮、多尿、毛干枯、无光泽、精神萎糜、畏寒、倦缩，严重者出现肌肉震颤、抽搐、衰竭而死亡。
　　2．血液学检查
　　各给药组大鼠，在给药前红系指标低，均处于贫血状态，与正常对照组相比，t检验有极显著性差异(p＜0.01），给药后各组红系指标均升高，与注射生理盐水的模型组相比，t检验有极显著差异（P＜0．01），且高、中、低不同剂量组间有梯度关系（中、高剂量组不太明显）。
沈阳三生制药股份有限公司益比奥与美国Amgen公司制品，注射剂量相同，其效果一致，二组t检验无显著性差异(P＞0.05）。停药后，各给药组红系指标逐渐下降。
　　3．血液生化学检查
　　各给药组大鼠，给药前尿素氮(BUN)、肌肝(Cr)值均升高，与正常对照组相比，t检验有极显著性差异（P＜0.01）；给药后各组大鼠 BUN及Cr值与给药前相比，变化不大；给药各组与模型组相比，t检验无显著性差异
（P＞0.05）。
　　4．病理组织学检查
　　已造模大鼠，检药前两肾呈灰白色，肾表面凹凸不平，二肾增大或缩小。显微镜下检查，肾皮质萎缩，肾小球数目减少，肾小管囊状扩张，肾皮质广泛腺瞟吟异物肉芽肿，肾间质纤维细胞增生。
　　给药后，各组大鼠肾单位处于不同恢复阶段，肾小球毛细血管丛增生，红细胞增多，肾小管内有蛋白管型，肾皮质腺瞟吟异物肉芽肿有所减少，肾间质纤维化程度同前。
　　5．综上所述：
　　各给药组用益比奥治疗后，大鼠红系指标明显升高，说明对慢性肾衰性贫血有纠正作用，可以治疗慢性肾衰性贫血，但停药后红系指标逐渐下降，说明需长期注射 rhuEPO，才能维持红系指标。用rhuEPO治疗后BUN及Cr变化不大，说明对慢性肾衰无治疗作用。

　 急性毒性

　　本试验由东北制药总厂完成
　　取作重18一20g健康昆明种小白鼠20只（雌雄各半），将益比奥用生理盐水配制成所需浓度，以100万IU/kg之剂量给小鼠皮下注射(0.5ml/20g体重），观察药后七天内动物反应情况。毒性反应：受试鼠药后七天内未见异常反应。动物尸检：药后七天将受试鼠处死剖检，胸腹腔各脏器未见明显病理改变。益比奥对小白鼠（SC）的LD50＞100U/kg（相当于临床初始剂量的6700倍，临床使用最大剂量的3330倍）。

　 长期毒性

　　本试验由东北制药总厂完成
　　1. 大白鼠长期毒性
　　本文报告沈阳三生制药股份有限公司研制益比奥对大白鼠的长期毒性，以该品40、200、1000IU/kg之剂量给大鼠SC，每日一次，连续五周。经五周长毒试验受试鼠无死亡，各组动物药后活动、行为状态未见异常，在给药中期发现高剂量组多数大鼠的四肢及耳完发红，中剂组次之，但停药后很快便恢复。高剂量组（♂）药后体重增长明显抑制，进食量减少，在恢复试验中均已恢复。
　　血液学：中、高剂组（药后）红细胞、网织红细胞及血红蛋白值均有明显增加，高剂组血小板值明显降低，但停药后均有所恢复。
　　血液生化指标：高剂组（药终），天门冬氨酸氨基转换酶明显增加，血糖及总胆固醇降低，其变化与对照组比较差别有显著意义，但停药后恢复试验结束，均已恢复。
　　系统尸解和组织学检查：高剂量组，脾肿大，脾重量和脾体比均明显增加，恢复试验结束其值也高于其它三组，肾上腺体比也有增加。中、高剂量组（药终）脾充血。红细胞髓外造血亢进，含铁血黄素减少，肝充血，含铁血黄素减少，部份鼠有红细胞髓外造血，肾充血，恢复试验后上述改变多数动物均已消失。给药三组及对照组在心、肝、脾、肺、肾、肾上腺、胃、肠、脑、睾丸等脏器均未见药物中毒性病理改变。
　　2. 狗长期毒性
　　本文报告沈阳三生制药股份有限公司研制的益比奥对狗的长期毒性。以该品150、1000IU／kg之剂量给狗静脉注射每日一次，连续四周，受试动物无死亡，各组动物一般观察活动、行为状态未见异常，高剂组在给药中期出现结膜充血、口腔粘膜发红等现象，但停药后很快就消失。
　　血液学检查（药终）高剂组：红细胞、网织红细胞及血红蛋白值明显增加，低剂组上述指标也有所增高，在停药二周后多已基本恢复。血液生化检测：除高剂量组(药后)天门冬氨酸氨基转换酶有一过性增高及血糖降低外，其它各项均未见明显变化。各组尿液分析及心电检查均基本正常。
　　系统尸解及组织学检查：高剂组（药终）剖检多有脾肿大，肝体比、肾体比增高，病理切片所见脾脏有红细胞遗外造血象，肝脏含铁血黄素减少或消失等，上述之改变在恢复试验中均已恢复。总之，给药二组及对照组在心、肝、脾、肺、肾、肾上腺、胃、肠、脑、睾丸等脏器均未见药物中毒性病理改变。

　 局部刺激

　　1．过敏试验
　　选40只豚鼠按体重性别随机分为四组，每组10只，第一组：溶媒对照组(0.5%白蛋白，0.9%NaCl）。第二组为益比奥，第三组为益比奥， 皮下注射后，用益比奥半成品攻击，第四组为益比奥半成品（3000IU/ml），每只豚鼠分别隔天皮下注射各受试物0.5ml，连续三次，然后将每组豚鼠按性别体重再随机分为两组，两组分别于第一次注射后的14天和第21天静脉注射受试物2ml， 第一组注射溶媒，第二组注射益比奥成品，第三组注射益比奥半成品，第四组注射益比奥半成品。
　　结论如下：益比奥成品及溶媒过敏反应呈阳性是由益比奥成品中加入白蛋白造成而非EPO作用所致，即重组人红细胞生成素不会引起过敏反应。
　　2．皮肤刺激试验
　　选豚鼠15只，随机分为三组，第一组两侧分别涂生理盐水与受试物，第二组两侧分别涂生理盐水与溶媒，第三组两侧分别涂溶媒与受试物。每次将受试物及对照物1ml涂于受试物区、溶媒区与对照区。用适当方法固定24小时后用温蒸馏水去除残留受试物、对照物，每日涂抹一次，连续一周。在最后一次涂抹24小时后去除残留物，并观察其后1，24，48，72小时涂抹部位有无红斑和水肿等情况，以及上述变化的恢复情况和时间。
　　结果表明， 生理盐水、溶煤以及益比奥各级皮肤刺激强度均为O＜0．5，因此可以得出入重组红细胞生成亲成品（益比奥）及其溶媒对皮肤均无刺激性。


　益比奥Ⅱ临床资料
　　
　　本试验由北京协和医院、解放军总医院、中山医科大学附属第一医院、第二军医大学长征医院和中国医科大学第一附属医院等多家医院共同完成。
　　1. 试验方法
　　1）治疗组：
　　给药剂量：参照临床治疗的有效给药剂量，血液透析、腹膜透析病例100－150u/kg/w，非透析治疗病例80-100u/kg/w，均分2～3次给予。治疗过程中以每4周为一观察单位，若无明显治疗反应及不良反应，增加15-30u/kg/w继续治疗，直至出现治疗反应。治疗过程中，当HCT＞3O％及NB超过100G/L，益比奥可减量1/4-1/3继续维持用药。
　　给药途径：血液透析病人选择静脉注射，腹膜透析及非透析治疗病例均选择皮下注射。
观察时间：8-12周
　　2）对照组：
　　选用日本麒麟公司利血宝或德国宝灵曼公司生血素，给药剂量、疗程、给药途径及剂量调整等同治疗组。
　　2．试验结论
　　1）三生公司产益比奥治疗肾性贫血疗效确切，总有效率为91.8％，显效率为55.7％，有效率为36.l％，无效率为8.2％；
[注]III期临床验证总有效率为93.8%。
　　2) 三生公司产益比奥的治疗反应，包括显效率、总有效率、血红蛋白和红细胞压积的升高幅度和速度，与进口同类产品相当；
　　3) 三生公司产益比奥可以采用皮下及静脉给药。主要不良反应有血压增高、注射部位疼痛、头痛等，多数不需停药即可好转.其不良反应发生率与进口产品无显著差异。未发现明显的脏器毒性及其它严复不可逆损害，非透析治疗病例用药期间肾功能未见明显显恶化。没有因皮试阳性而剔除的病例。
　　总之，三生公司产益比奥沈阳是一种治疗肾性贫血的安全、有效药物。

　益比奥临床应用

　(一) 适应症

　　肾性贫血，包括透析及非透析病人。
　　[注] 益比奥已开始进行围手术期红细胞动员的临床试验，总病例99例，益比奥治疗组52例，对照组47例。治疗组自手术前10天至手术后4天，给予益比奥皮下注射，150IU/kg，每周3次，共治疗2周.治疗期间常规口服补铁，酌情给予抗凝药物如阿司匹林，对照组不给予益比奥，其它同治疗组结果表明：
　　1) 益比奥能促进手术病人的红细胞生成；
　　2) 益比奥能减轻术中、术后贫血程度，加速术后贫血恢复；
　　3) 益比奥能明显减少病人术中、术后对异体输血的需求；
　　4) 受试者对益比奥的使用剂量多能耐受，仅出现4例轻度（I级）不良反应，为发现益比奥相关的高血压及其它不良反应。

　(二) 剂量与用法

　　本品应在医生的指导下使用，可皮下注射或静脉注射，每周分2-3次给药。给药剂量需依据病人贫血程度、年龄及其它相关因素调整，以下方案仅供参考：
　　治疗期：起始剂量血液或腹膜透析患者每周100-150国际单位（IU）/公斤体重，非透析病人每周75-100IU/公斤体重。若红细胞压积每周增加少于0.5vol%， 可于4周后按15-30IU/公斤体重/周.红细胞压积应增加到
30-33vol%一般不宜超过36vol%。
　　维持期： 如果红细胞压积达到30-33vol%或/和血红蛋白达到100-110克/升，则进入维持治疗阶段.将剂量调整至治疗期剂量的2/3，然后每2-4周检查红细胞压积和血红蛋白在适当水平。
对血液透析病人，多采用静脉给药。对腹膜透析或非透析病人，皮下给药较好一点。

　(三) 副作用

　　红细胞生成素耐受性良好， 副反应多较轻微.
　　1.一般反应： 少数病人用药初期可出现头痛、低热、乏力等， 个别病人可出现肌痛、关节痛等，绝大多数不良反应可以自行好转，不影响继续用药。极个别病例上述症状持续存在，应对症处理或停药。
　　2．过敏反应：极少数患者用药后可能出现皮疹或荨麻疹等过敏反应，包括过敏性休克。因此，初次使用本品时，建议先注射少量，确定无异常反应后再注射全量，如发现异常，应立即停止用药并妥善处理
　　3．心脑血管系统：少数患者可出现血压升高，因此治疗期间定期观察血压变化，必要时应减量或停药，并调整降压药物的使用。
　　4．血液系统：随着红细胞压积增高，血液粘度可相对增高，因此应注意防止血栓形成，并适当给予抗凝剂治疗。
　　5．胃肠：有时会有恶心、呕吐、食欲不振、腹泻情况发生。

　(四) 禁忌症

　　高血压失控病人，对哺乳动物细胞衍生物过敏及对人血清白蛋白过敏者禁用本品.

注意事项

　　1．本品用药期间应定期检查红细胞压积（用药初期每星期一次，维持期每两星期一次），注意避免过度的红细胞生成（确认红细胞压积36vol%以下），如发观过度的红细胞生成，应及时调整用药剂量。
　　2．对有心肌梗塞、肺栓塞、脑梗塞患者，及有药物过敏病史的患者应慎重给药。
　　3．高龄者应用本品时，因其生理机能低下，多患有高血压和循环系统疾病并发症，要注意监测血压及红细胞压积，并适当调整用药剂量和次数。
　　4．应用本品可能会引起高血钾症，应适当调整饮食，若发生高血钾症，应遵医嘱调整剂量。
　　5．治疗期间因出现有效造血，铁需要量增加，通常会出现血清铁浓度下降，如果患者血清铁蛋白低于100ng／ml，或转铁蛋日饱和度低于20％，应每日补充铁剂。
　　6．对孕妇、哺乳妇女及儿童使用本品的安全性尚未确定。
　　7．如病人对本品治疗4-8周后，没有反应或未能维持反应，则须考虑和评估如下影响因素：
　　缺铁、潜在感染、炎症或某些恶性病变、叶酸或维生素B12缺乏、 隐性失血如胃肠出血、血透析及透析相关的失血、铅中毒、溶血性疾病、甲状旁腺素增高。

其它内容

　　1．使用方法
　　　采用无菌技术，打开药瓶，将消毒针连接消毒注射器，吸入适量药液，静脉或皮下注射。
　　2．规格
　　　每瓶装量l.0ml，含有红细胞生成素2000、3000或40001U。
　　3．贮存
　　　本品贮存于2一8℃，勿冻，勿热，勿振摇。
　　4．有效期
　　　2一8℃条件下，有效期2年。
　　5．批准文号
　　　2000国际单位，国药准字（1998）沈三生S一01号；
　　　3000国际单位，国药准字（1998）沈三生S-02号；
　　　4000国际单位，国药准字（1998）沈三生S-03号。
　　6．制造单位
　　　沈阳三生制药股份有限公司
　　7．地址
　　沈阳经济开发区十号路1甲3号（110141）